英文题目：TargetedRP9ablationandmutagenesisinmousephotoreceptorcellsbyCRISPR-Cas9中文题目：利用CRISPR-Cas9技术对小鼠感光细胞RP9基因进行敲除和定点突变合作单位：温州医医院发表杂志：ScientificReports影响因子：4.
研究背景
壹
真核细胞中前体mRNA(Pre-mRNA）的剪接是一种重要的生物过程。已有研究表明，许多剪接体基因的突变会引起人类眼疾。Rp9（pre-mRNA剪接因子，又被称为PAP1），其突变容易导致早发性和严重视力丧失的常染色体显性遗传视网膜色素病变(autosomaldominantretinitispigmentosa，adRP)。然而，由于没有合适的体外或体内疾病模型，Rp9突变引起感光细胞退化的分子机制尚不明确。CRISPR/Cas9技术可以高效方便地对真核细胞基因组进行编辑。因此，作者利用该技术构建了Rp9基因敲除以及定点突变（患者中存在的突变位点）细胞系模型，以期研究Rp9引起的视网膜色素变性的机制。
NGS研究方法
贰
研究材料：小鼠视网膜感光细胞W（视锥细胞系）实验分组：Rp9-KI（Rp9c.AT点突变组）和Rp9-KO（Rp9敲除组），以及W对照组测序方法：转录组测序（Illumina），3个样本：KI、KO和对照各1个样本
研究结果
叁
1
W感光细胞系来源于视锥细胞
视网膜上包括视杆细胞和视锥细胞，视杆细胞能够感受弱光，而视锥细胞赋予生物色觉，而且在强光下工作效果更好。为鉴定小鼠W细胞是视锥细胞还是视杆细胞，对W细胞系进行感光细胞特异性标记蛋白免疫染色。结果显示，视锥细胞特异性标记（红色或绿色视蛋白—图A、蓝色视蛋白—图B以及视锥-视紫红质抑制蛋白—图C）染色为阳性，而视杆细胞特异性标记（视紫红质—图D）染色为阴性，表明W细胞系是来源于视锥细胞的。
2
构建Rp9基因敲除/点突变细胞模型
sgRNA设计及特异性验证：设计针对靶向Rp9不同区域的sgRNA（图A，2个sgRNA序列及用于介导同源重组修复HDR引入点突变c.AT而设计的Targeting载体，该载体包括侧翼区的CMV-Neo元件和包含Rp9点突变的同源臂序列）。将克隆到Cas9载体的2种sgRNA分别转染?W细胞系，通过T7E1（该酶能够识别不完全配对DNA并对其进行切割）酶切法分析切割效率。结果显示sgRNA-1和sgRNA-2是有效的，能够特异性切割基因组DNA产生突变，相对于只转染Cas9载体的对照组，突变频率分别是23%和19%（图B）。
接下来将克隆到Cas9载体的2种sgRNA和Targeting载体共同转染W细胞，G连续筛选，最终筛选出22个细胞单克隆用于基因型分析。通过PCR和一代测序结果表明，克隆5具有2种不同长度的扩增片段，其中一个片段与设计的targeting载体序列长度相符（图C），且测序分析表明克隆5含有点突变c.AT（图D），说明其为杂合型Rp9-KI细胞。其它细胞克隆测序结果表明有5个杂合Rp9-KO细胞（图D）。
3
Rp9-KI和Rp9-KO细胞增殖和迁移能力降低
为了检测Rp9突变是否对细胞造成一定生物学效应，对2种细胞类型进行增殖和迁移能力检测。结果表明，相比对照组细胞，KI和KO细胞的增殖（图A，MTT实验）和迁移能力（图C，划痕实验）明显下降，WB实验也证实增殖相关蛋白表达明显下降（图B）。
4
转录组测序分析组间差异-筛选关键基因
对W、Rp9-KI和Rp9-KO细胞进行转录组测序，与对照组相比，KI组和KO组分别有和个差异表达的基因（图A和B），在共有差异表达基因中，包含表达量下调的视网膜色素病变（RP）相关基因-Fscn2（图C）。后续qRT-PCR验证结果也表明该基因在两种类型细胞确实显著表达下调。在对其他视网膜色素病变（RP）相关基因的验证结果中，发现Bbs2同样在2组中表现出明显下调。
5
RP9突变抑制Fscn2的前体mRNA剪接
以往研究报道过PRPF31突变抑制视网膜特异基因RHO剪接，因此为了证实PR9突变是否也抑制视网膜特异性剪接底物基因的表达，作者选取了Fscn2和Bbs2基因进行验证。验证结果表明相比对照组，Fscn2剪接在KI和KO组受到明显抑制，Bbs2没有表现出抑制结果。
小结
该研究表明Rp9突变明显抑制细胞增殖和迁移。此外，在Rp9突变细胞中常染色体显性遗传视网膜色素病变(adRP)相关基因Fscn2的剪接被显著抑制。本研究揭示了广泛表达于多种组织的RP9和疾病特异性基因之间的功能关系，解释了为什么非特异性表达的剪接因子的突变可能导致adRP。
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