抗体专辑关于抗体药物的性能优化，你不能

编辑寄语

抗体药物是未来生物药的主力军，也是创新药研发的重中之重。FDA历年批准的原创新药中，抗体药物所占据的比例越来越高，越来越多的科学家也积极投入到这一研究领域：其受重视的程度可见一斑。近年来，围绕创新驱动国家战略，鼓励创新的政策密集出台，制度改革不断释放发展红利，中国创新药物研发，尤其是以抗体药物为主导的生物药研发将迎来新的时代。

年是抗体药物研发领域极其不平凡的一年。在这一年，专注于搭建治疗性抗体领域全球华人交流合作平台及中国抗体药走向世界桥梁的非营利专业协会——华人抗体协会正式成立并召开了第一次年会；也是在这一年，《药学进展》与华人抗体协会签署了战略合作协议。尽管相隔大洋两岸，未曾有过会晤，但多次的线上对话已让双方加深了对彼此的了解，也凝聚了在努力推进中国抗体药研发进程方面的共识，终于，这本历时半年精心酝酿和策划的抗体专刊在金秋十月如期出版。

此次致力于抗体专刊出版的专家来自军事医学科学院基础医学研究所、沈阳药科大学、上海岸迈生物科技有限公司、美国马萨诸塞大学医学院、SYL咨询公司、南京大医院、加州大学洛杉矶分校、抗体工作室有限公司，他们在抗体专刊的选题策划、组稿、撰写直至最终出版的过程中不辞辛劳，付出了大量的时间和精力。《药学进展》特此向他们致以最诚挚的谢意！

抗体专刊的四篇综述，覆盖了抗体产业链从上游到下游的热点话题：美国马萨诸塞大学医学院内科系卢山教授介绍了DNA免疫技术在高质量单克隆抗体诱导开发中的应用进展；抗体工作室有限公司创始人刘跃博士介绍了治疗用单抗的人源化和优化；上海岸迈生物科技有限公司总裁吴辰冰博士综述了双特异性抗体技术及双特异性抗体在肿瘤治疗、炎症治疗和抗病毒治疗中的应用进展；“千人计划”专家、沈阳药科大学马宁宁教授担任此次抗体专刊的栏目主编，策划选题同时，以独到的视角聚焦抗体下游领域，阐述了抗体大规模生产中的反应器放大策略并给予了很好的建议，并邀请到军事医学科学院基础医学研究所沈倍奋院士为抗体专题点评（抗体专辑｜抗体药物研发四大看点：创新之路向何方？（Ⅰ））。

最后，特别感谢华人抗体协会创始人王守业博士的鼎力支持以及他在促进双方合作中不遗余力的努力。抗体专刊既是华人抗体协会专家智慧的结晶，更是《药学进展》与华人抗体协会相知相识、携手助力抗体药物研发的最好见证！

在今天发布的文章中，刘跃博士将与我们分享治疗用单抗的人源化和优化策略，这也是本期抗体专刊中的最后一篇综述。欢迎各位读者朋友阅读、讨论，如果您希望了解更多关于抗体药物研发领域的资讯，欢迎联系本刊编辑部与华人抗体协会！提前祝大家周末愉快！

(文：郑晓南，杨臻峥)

专家介绍

刘跃：博士，拥有22年的抗体药物研发经验，参与并主持过14个治疗用抗体的研发工作。其中2个抗体已进入Ⅱ期临床。在22年的职业生涯中，刘博士领导和参与过多种疾病的治疗用抗体研究，其中比较重要的工作包括研发抗血栓抗体对心肌梗死和静脉栓塞进行导向显像和导向溶栓，研发能被肿瘤特异性内吞的抗体对肿瘤进行抗体偶联药物治疗，研发针对阿尔茨海默病和帕金森病的治疗用抗体，研发针对视网膜黄斑病变的治疗用抗体及针对多种罕见病的治疗用抗体。刘博士是9项已发表的国际专利申请的主要发明人，也是多篇科研文献的主要作者。刘博士曾供职于DigitAbInc.（—）、UCSF（—）、ElanPharmaceuticals（—）和ProthenaBioscience（—）并担任Prothena的创新俱乐部负责人。年初，刘跃博士作为共同创始人在旧金山湾区创建了AbStudioInc.，并担任CEO一职。

正文

治疗用单抗的人源化和优化

焦静1，刘跃2*

（1.加州大学洛杉矶分校,加利福尼亚州洛杉矶；2.抗体工作室有限公司，加利福尼亚州海沃德）

[摘要]近年来，治疗用抗体领域的竞争越来越激烈，开发成功的治疗用抗体的成本也越来越高。去除抗体免疫原性、优化抗体的生化和生物物理性质的新方法由于旨在增强抗体的“可开发性”，引起了业界的普遍重视。文章总结了一些抗体序列的优化方法，旨在为治疗用单抗的深度开发提供参考。

自从首例治疗用抗体OrthocloneOKT3于年被FDA批准以来，有73种重组抗体陆续被FDA批准，还有超过种治疗用抗体处于临床研究阶段。随着治疗用抗体领域的竞争越来越激烈，开发治疗用抗体的成本也越来越高。去除抗体免疫原性、优化抗体的生化和生物物理性质的新方法由于旨在增强抗体的“可开发性”，越来越引起业界的重视。进入临床研究的单克隆抗体（mAb）根据其序列来源主要可分为以下4类：鼠源、嵌合（鼠可变区序列加人恒定区序列）、人源化（人序列具有鼠互补决定区）和全人（抗体来自能产生人抗体的转基因鼠或来自人B细胞）。本文着重讨论鼠单克隆抗体的人源化和优化过程。

1抗体人源化

由小鼠、大鼠和其他动物产生的单克隆抗体对人体具有免疫原性。为了降低免疫原性，可以将鼠类抗体的可变区融合到人抗体恒定区而产生嵌合抗体。为了进一步降低免疫原性，嵌合抗体的可变区可以被进一步修饰以提高其与人体天然抗体的相似性，这样就产生“人源化抗体”。这个“修改过程”被称为“抗体人源化”。抗体人源化通常通过研究比较小鼠抗体蛋白序列与同源人抗体序列之间的差异来进行设计。在每个小鼠和人类不同的氨基酸位点上，必须进行选择：如果变换成人的氨基酸不会影响抗体的抗原结合亲和力或不显著降低抗体的“可开发性”，可以选择人氨基酸；否则，保持小鼠氨基酸。很多种方法可用于抗体人源化设计。计算机辅助设计、噬菌体展示和酵母展示是3种广泛使用的方法。计算机辅助设计先建立鼠源抗体的三维模型结构，用电脑软件来分析结构和设计突变。噬菌体展示和酵母展示则是通过建库涵盖鼠和人氨基酸差异的所有组合可能性，再通过筛库来选择人源化程度最高、抗体其他属性也最好的序列作为治疗用抗体的候选序列。如果只修饰抗体序列的框架区，该过程通常被称为互补决定区（CDR）移植；如果框架和CDR区都被修饰，只有与抗原直接相互作用的特异性决定碱基（SDR）不变，则该过程称为SDR移植。

在计算机辅助设计领域，Schrodinger和MOE等传统软件在不断地更新及优化，一些新的工具软件也在不断涌入。例如，一个名为Tabhu的新的网页服务器下的工具软件除了可用于人源模板选择、移植、反向突变评估、抗体建模和结构分析外，还可以从2个不同的数据库中分别选用与异种V区具有最高序列相似性的人源框架供体来进行抗体人源化设计。Tabhu还有一种用于CDR移植和亲和力预测的新方法proABC，并且可以运行procheck和EDTSurf以提醒用户在人源框架中引入鼠源反向突变是否会引起抗体结构的改变。

2抗体去免疫源性和增加耐受性

尽管mAb的人源化是减少抗体对人免疫系统产生外源反应的一种方法，但完全人源化mAb仍然可以具有免疫原性。许多因素（如聚集、剂量、途径和靶标）可以引起治疗用抗体的免疫原性，其中一个主要因素是T细胞抗原表位的含量（其他还有B细胞表位、MHCII表位和抗原性表位）。有多种工具可以用来预测抗体序列中的T细胞表位。因为大多数这些工具不能显示预测的抗原表位是否显示在蛋白质表面（将被人类免疫系统检测到），所以来自线性序列预测的信息必须和其在抗体3D模型上的位置结合起来进行分析，当然最好可以进行试验验证。

除了尽量消除抗体序列自身的免疫原性以外，DeGroot等还报道了另一种降低抗体免疫原性的新方法，这就是所谓的诱导免疫耐受。通过将Treg表位引入抗体来增加人免疫系统对抗体的耐受性。Treg表位将刺激Treg功能并诱导其对抗体产生免疫耐受。这种新方法是改善生物制剂“设计质量”的手段，可以用来研发免疫原性较低的治疗性抗体。

3抗体亲和力成熟

结合亲和力是治疗性抗体最关键的特性之一。因此，用于提高抗体的抗原结合亲和力的方法具有广泛的应用价值。这些方法包括随机诱变、靶向诱变、重亲链洗牌重配和电脑模拟设计。前3种方法通常使用展示技术进行，如噬菌体展示。电脑模拟借助计算机辅助设计，是一种与其他方法相比较新的方法。BioLuminate是具有“亲和力成熟”功能的软件之一。为了优化抗体的结合亲和力，需要分析抗体和抗原复合物的三维结构。对于那些没有可用于分析的真实晶体结构的抗原-抗体复合物，可以建立抗原-抗体复合物的同源模型：将抗原的多肽片段通过“分子锚接”插入到3D同源抗体模型中或者通过“蛋白质-蛋白质对接”，将抗原同源性模型直接锚接到抗体同源性模型中，然后进行亲和力成熟计算，尽管该方法的准确性可能因抗体特性而异，但也不失为一种值得考虑的新方法。

4抗体特异性优化

为了降低抗体对其他抗原的交叉反应性，扩大抗体对相关抗原的特异性或改善抗体对不同物种抗原的结合力，需要对抗体进行工程改造以优化其特异性。随机诱变和靶向诱变是2种常用优化抗体特异性的方法。如果有抗体-抗原复合物的3D结构可参考，也可将人表位突变为另一种种系的表位（例如猴表位或鼠表位），通过使用软件的“亲和力成熟功能”来预测和引入能优化异种抗原亲和力的突变。

5抗体Fc端的功效改善

除了通过改变IgG的可变区来提高抗体的抗原结合能力外，还可以通过Fc工程化来调节抗体的生物学效应。以往研究证明，根据需要将突变引入抗体的Fc结构域可以改善或减少抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC），抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP）和抗体诱导的补体依赖性细胞毒作用（CDC）。例如，已经鉴定的Fc结构域内的许多突变可以直接或间接增强Fc受体的结合，从而增强细胞的细胞毒性：基因泰克的研究人员鉴定了突变SD/AL/IE（被称为3M），MedImmune公司鉴定了突变FL，Xencor公司鉴定了GA。所有这些突变导致了抗体诱导的ADCC、ADCP和CDC的改善。

另外一种改进Fc和FcγRs相互作用的方法是Fc结构域的糖基化。已知FcγR与CH2结构域上的碳水化合物相互作用，并且这些聚糖的组成对抗体功能活性具有实质性影响。其一个很好的例子是岩藻糖基化抗体显示出增强的ADCC活性，因为糖基化增加了抗体与FcγRIIIa的结合。

不同于癌症治疗需要ADCC、ADCP和CDC提高的抗体，当用抗体来治疗炎症和一些其他疾病时，需要不具备激活效应功能的抗体。为了达到这个目的，IgG4的使用是一个选项。但是这个IgG亚类有Fab-臂交换的独特能力，虽然一些研究已经显示IgG4铰链结构域中的几个突变可能会阻止体内臂交换，IgG4的应用依然是个挑战。另一个方法是：通过Fc工程化来降低IgG1的Fc与Fcγ受体和C1q的相互作用。通过丙氨酸扫描，Duncan等首先鉴定了C1q与Fc结构的铰链区和CH2区的结合位点。然后，Genmab公司的研究人员鉴定出突变体KA、LA和LA组合足以完全消除FcγR和C1q结合。以类似的方式，MedImmune公司后来确定了一组3个突变，LF/LE/PS具有非常相似的影响。其他已经报道过的用以减少ADCC、ADCP效应的Fc突变还包括IgG4FA/LA突变、IgG1LA/LA/GA突变等。

降低治疗性抗体效应功能的另一种方法是Fc区的天冬酰胺上的糖基化修饰。研究已知该位点是Fc-FcR相互作用所必需的。在N点突变、酶解脱羰基化的Fc结构域，或在表达体系中有糖基化抑制剂存在的条件下或在细菌表达体系中，Fc与FcRs的结合均会显著下降或丧失。

6抗体药代动力学改善

改善治疗用抗体的药代动力学特性能够降低剂量并降低成本。这种改善也延长了给药间隔而方便患者，所以也是抗体工程化的一个研究方向。

治疗用抗体在人体内的清除通常由2种机制引起：①非特异性清除：抗体被细胞非特异性内吞；②特异性清除：抗原结合介导内化和清除。

6.1减少非特异性清除

为了减少治疗用抗体的非特异性清除，研究人员曾尝试降低抗体的等电点，成功地提高了其研究的抗体的半衰期。因此，从抗体变体文库（通常是随机位点诱变产生）或来自不同人源化设计的文库中选择低等电点抗体是选择具有低非特异性清除率的治疗用抗体的2种方法。以前的研究还表明，通过增加Fc/FcRn相互作用的Fc工程化可以改善IgG的非特异性清除率。PDLBioPharma的研究人员发现，TQ/ML双突变体在恒河猴体内的IgG半衰期增加了近2倍，MedImmune公司的研究人员发现突变MY/ST/TE（YTE）导致IgG半衰期在食蟹猴体内增加了约4倍。

6.2减少抗原结合介导的清除

为了减少抗原结合介导的抗体内吞和清除，可以选择或研发具有pH选择性的抗体。这类抗体在生理条件下与抗原结合而在低pH（内涵体的pH为6.0）条件下与抗原解离。开发pH敏感抗体有3种方法。前2种方法与用于减少抗体的非特异性清除的方法相同，是从抗体变体文库或人源化变体中选择pH敏感抗体。第3种方法称为“His扫描”，类似于“Ala扫描”，它依赖于在蛋白质界面中合理引入可离子化基团。质子连接的基础热力学决定了多个可离子化基团的存在，其与蛋白质结合后经历pKa变化，是导致pH依赖性结合所必需的条件。

7抗体成药性的改善

治疗用抗体的良好药物性质包括：良好的热稳定性、良好的溶解性、良好的化学稳定性和较小的异质性。这些性质有助于在储存期间较好地保留抗体的生物活性，减少聚集以减少免疫原性，提高生产率以降低商品成本，实现高浓度制剂并确保制造中的良好质控。

7.1改善热稳定性

热稳定性差可能导致抗体聚集和低表达。Vogt等检查了16个至少包含1个已知嗜热三级结构和1个已知嗜温三级结构的蛋白质家族的氢键和盐连接的数量和类型、极性表面组成、内部空腔和包装密度以及二级结构组成情况。结果表明，随着热稳定性的增加，氢键的数量和极性表面积分数也一致增加。因此，为了提高抗体的热稳定性，需要优化疏水性核心和带电荷簇残基。依靠数据库的点突变研究和计算机的设计是此优化过程可以应用的2种方法。

7.2改善溶解度

高浓度的制剂对于在患者中应用治疗性抗体较为重要，特别是用于治疗慢性疾病。由于单次皮下注射的体积通常限制在小于1.5mL，皮下注射通常要求抗体制剂具有高浓度。这需要作为临床候选药物的抗体具有良好的溶解性和黏度。因此，抗体溶解度的改善对于治疗性抗体发展至关重要。类似于优化热稳定性，去除表面疏水性是提高抗体溶解度的主要方法，可以应用与优化热稳定性相似的方法来改善抗体溶解度。

7.3提高化学稳定性

化学降解如脱酰胺基化、异构化、琥珀酰亚胺形成、甲硫氨酸和色氨酸氧化以及CDR区域中未配对的半胱氨酸的半胱氨酰化常常导致治疗性抗体的效力降低，并且可能是药学研究（chemistry，manufacturingandcontrols，CMC）中需要额外控制的问题。因此，抗体临床研发应该尽量避免这些影响因素。另一影响因素是在抗体蛋白质结构表面上的酶解位点。应用晶体结构或计算机构建的3D模型结构来研究并改良抗体结构表面的这些特性或通过噬菌体/酵母/哺乳动物文库进行随机或靶向突变可以解决这类问题。

7.4降低异质性

蛋白翻译后的糖基化、N-焦谷氨酰胺环化修饰可以引起抗体蛋白的异质性，这也是引起不同生产批次之间抗体质量不一致的主要原因，也是抗体工程化改造经常遇到的一个问题。具有这些修饰的抗体需要在制造中进行额外的质量控制，这增加了商品的成本。如果这种异质性不能通过控温等其他方法避免，还可以通过“靶位点突变”去除可以引起抗体异质性的氨基酸。

8结语

本综述总结了优化治疗用抗体以获得更好的成药性的一些方法（见表1）。通过使用展示技术、计算机辅助设计和位点诱变工程抗体，可以改善治疗用抗体候选物的各种性质。这些性质包括抗原结合亲和力/特异性、生物功效、PK/PD和免疫原性。只有优化所有这些特性，从全局出发设计抗体序列，才能研发出最好的治疗用抗体。在本综述提及的方法中，电脑辅助设计是发展最快的一个领域。抗原和抗体的结合主要由氨基酸侧链间形成的离子键（ionicbond）、氢键（hydrogenbond）和疏水相互作用（hydrophobicinteraction）决定。可以相信，在不远的将来，随着计算能力和速度显著提高的超级电脑的诞生及三维蛋白结构数据库的扩大，对这些侧链相互作用的计算和预测将会变得越来越精准和高效。