编者按：
近年来，抗VEGF药物的出现，为治疗视网膜血管病变提供了强效对策，并逐渐成为了一线治疗。然而眼科学者从未停止探索的步伐，近年来关于视网膜血管病变的基础研究屡见报道。近日，小编就在ClinExpOphthalmol上注意到这样一项研究——Justine教授团队验证了靶向抑制Nox4（NADPHoxidase还原型辅酶氧化酶家族之一）有望成为治疗视网膜血管病变的新方向1。且听小编正文分解，为你分享这项有趣的研究。
研究历程总览1、视网膜血管病变的氧化应激机制：ROS（活性氧）是元凶2、Nox家族是ROS产生的主要相关酶，于是学者考虑通过抑制Nox来治疗视网膜血管病变3、Nox家族存在不同的分型，研究特别选择了在人视网膜血管内皮细胞高表达的Nox4作为靶点来研究4、通过二甲基草酰甘氨酸（DMOG）诱导血管内皮细胞过表达Nox4，发现ROS水平上升，VEGF-A表达也上升5、通过选择性抑制Nox4，发现ROS水平下降，并且VEGF-A的表达也大幅下降6、为了确定是否可以应用Nox4抑制剂进行治疗视网膜血管病变，试验验证了其并不影响血管内皮细胞的生长绘卷揭开：细看研究的每一步
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对于视网膜血管病变，包括糖网、早产儿视网膜病变（ROP）及视网膜静脉阻塞等，广泛认可的机制是VEGF水平的升高引起血管渗漏及新生血管的形成，所以抗VEGF药物的问世，为治疗各种视网膜血管病变带来了强效对策。而从基础研究、更微观的角度——氧化应激机制来看，是活性氧（ROS）的过度生成引起了视网膜血管内皮的氧化损伤，包括视网膜内皮细胞的营养不良及丢失，并伴随VEGF的表达水平上升，从而导致了视网膜血管病变。因此如何调控、降低视网膜血管内皮细胞的ROS水平成为眼科学者的研究热点和兴趣所在。
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对于如何减少ROS带来的氧化损伤，眼科学者们做了不少努力。有学者直接使用抗氧化制剂来降低活性氧水平、中和自由基2；当然也有研究者将目光放在了调节产生ROS的主要酶——Nox酶家族上，这也正是Justine教授团队的主要研究内容。对于Nox家族，此前有不少的研究，公认的一点是：Nox是“专业产生活性氧”的一类酶。目前Nox酶家族已知有7类：从Nox1到Nox5，以及双氧化酶Duox1和Duox2。这些酶在结构、功能、组织分布上具有差异，而在强调精准化、靶向化治疗的今天，当然得先研究清楚是哪个酶在视网膜血管病变中起主要作用。
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Justine教授等人的研究首先选择不同人的视网膜血管内皮细胞，通过实时定量PCR来分析不同Nox酶成分的表达水平，结果显示表达最高的酶是Nox4（图1），这与前人得到的研究结果相一致。
图1.不同个体获得的视网膜血管内皮细胞表达不同Nox酶的情况
既然确定了Nox4是人视网膜血管内皮细胞主要表达的酶，Justine教授等人就开始了接下来针对Nox4开展的研究。
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他们设计通过DMOG来诱导Nox4的过表达（图2）。（小科普：DMOG是一种脯氨酰-4-羟基化酶抑制剂，可以增加细胞内的缺氧诱导因子（HIF），从而上调Nox4的表达3。）
图2.DMOG诱导了Nox4的过表达
在Nox4过表达的同时，发现伴随着ROS含量升高（图3）及VEGF-A表达的增加（图4）。
图3.通过荧光试剂CM-H2DCFDA（一种活性氧探针，只有被氧化才会发荧光）检测活性氧含量
图4.DMOG诱导后的VEGF-A表达量增加
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确实，Nox4的过度表达带来了预想的效果，但是不是Nox4的高表达引起的VEGF-A表达上升，其中的因果关系还不能说明。Justine教授进行了下一步研究，以高选择性NOX1/4抑制剂GKT及GKT（受限于目前还没有单一抑制Nox4的指定药物）来抑制Nox4的表达，观察ROS及VEGF-A的变化。
结果发现，抑制Nox4表达后，ROS水平以及VEGF-A的表达都下降了（图5）。
图5.选择性Nox1/4抑制剂GKT及GKT引起ROS含量与VEGF-A表达的改变
这下可以说明很多问题：一是Nox4的过度表达引起了视网膜血管内皮细胞的ROS及VEGF-A含量上升，这些与视网膜血管病变的形成直接相关；二是Nox4抑制剂能够下调ROS水平与VEGF-A的表达，无疑有利于治疗相关的视网膜血管病变。
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但是还应考虑到一个问题，Nox4抑制剂本身对视网膜血管内皮细胞是否会带来损害？毕竟视网膜血管病变的重要特征就是内皮细胞的丢失。因此，Justine教授团队对此展开了验证。通过对照试验发现，这两种Nox选择性抑制剂并不会影响血管内皮细胞的生长（图6）。
图6.通过CyQUANT细胞增殖分析试剂盒（荧光量反映细胞DNA含量，即细胞生长水平）来检测不同组的血管内皮细胞生长情况
小结
Justine教授团队通过这一系列下来的研究，验证了Nox4是视网膜血管内皮细胞中最主要表达的Nox酶，其过度表达会引起ROS水平升高及VEGF-A表达增加。通过Nox4抑制剂能够逆转这一效应，同时其不影响血管内皮细胞的生长。因此，Nox4抑制剂有望成为治疗视网膜血管病变的潜力股。Justine教授团队补充道，甚至可以将Nox4抑制剂应用到与视网膜内皮细胞氧化应激相关的疾病上，如增殖性玻璃体视网膜病变与后葡萄膜炎。
思与辨
但是笔者觉得仅凭当前的研究也不能把结果想得太乐观，毕竟以下的问题并没有得到解决：
1、如何确定视网膜血管内皮细胞在氧化应激状态下，Nox4也是Nox家族中最主要表达的酶？
2、如何确定是抑制了Nox4而不是Nox1引起的ROS水平及VEGF表达的下降？
3、如何保证这些Nox选择性抑制剂作用于眼部病灶而不引起全身不良反应？
最后，笔者希望关于Nox酶这一治疗靶点的研究能够更深入，促进新药的研发，让更多视网膜血管病变的患者有更多更好的选择来实现优质视界。
参考文献：1.BinoyAppukuttan,etal.EffectofNADPHoxidase1and4blockadeinactivatedhumanretinalendothelialcells.ClinExpOphthalmol.Aug;46(6):-.Doi:10./ceo..EpubFeb23.2.ChengLi,etal.OxidativeStress-RelatedMechanismsandAntioxidantTherapyinDiabeticRetinopathy.OxidativeMedicineandCellularLongevity,Volume,ArticleID,15pages.
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