重写教材抑癌基因RB作用机制模型需更新_视网膜病变

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辽宁白癜风医院

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撰文

咸姐

#基因转录调控与表观遗传#

RB是最早被确定的肿瘤抑制因子之一，其在正常细胞中广泛表达，但在癌症中功能失活。对RB的研究历史悠久，其作用机制似乎用一个简单的模型就能描述——RB与E2F调控的启动子相关，并通过抑制细胞周期基因的转录来阻断G1细胞周期进程。这种特性依赖于细胞周期，当细胞在G1期、衰老期间或检查点介导的细胞周期阻滞期间积累时，会产生活性RB。而有丝分裂信号可激活细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），使RB磷酸化并阻止其对E2F的抑制，从而增加E2F介导的转录并促进细胞周期进展。简言之，当细胞增殖时，RB在活性（非磷酸化）和非活性（高磷酸化）状态之间振荡。然而，随着研究的深入，人们逐渐发现RB除了对E2F的周期性调节外，还具有其他重要作用。此外，最近对功能不同的单磷酸化RB亚型（mP-RB）的鉴定也表明，RB的作用机制比以前认识到的更为复杂，并且强调了全面了解RB的基因组分布的重要性。显然，对RB作用机制的上述教科书式的描述已无法轻松解释RB作用的许多方面了，尤其该模型还无法解释RB肿瘤抑制活性具有组织特异性和环境特异性的原因。由此可见，RB作用机制的模型需要更新，需要一个融合了RB的经典和非经典活性的新模型。

年8月17日，来自美国哈佛医学院的MichaelS.Lawrence团队在MolecularCell上在线发表题为Chromatin-boundRBtargetspromoters,enhancers,andCTCF-boundlociandisredistributedbycell-cycleprogression的文章，首次确定了RB结合染色质的全谱，发现RB不是只靶向E2F启动子，而是可以与特定的启动子、增强子和绝缘子组相关联，以靶向不同的基因。同时，细胞周期进程可以将RB重新分配给细胞类型特异性增强子，并且引入PanChIP软件证实RB与不同类型位点的不同转录因子的相关性。

为了获得RB基因组分布的详细图谱，本文研究人员从表达特定RB亚型的人视网膜色素上皮细胞(RPE1)中获得了ChIP-seq图谱，这些细胞中的内源性RB被类似水平的外源性FLAG标记的野生型RB（WT-RB）或RBΔCDK（一种组成性活性等位基因，其中所有已知的体内CDK磷酸化位点均突变为丙氨酸）或14个mP-RB等位基因（仅包含一个完整CDK磷酸化位点）中的任一个所替代。分析结果显示，没有任何特定的亚型表现出唯一的结合位点，表明一般来说，单磷酸化不会将RB靶向独特的位点。同时，结果显示RB峰位于假定的启动子区域（距转录起始位点TSS-1kb至bp），有趣的是，70%的RB峰不在启动子中，而是在基因内和基因间区域。而RB在启动子和非启动子区域之间的分布是磷酸化依赖性的，WT-RB主要结合到非启动子区域，RBΔCDK和14个mP-RBs中的12个则优先结合到启动子区域，磷酸化位点的位置影响了这些形式的“活性”RB在启动子和其他区域之间的分布。

为了确定RB结合的染色质位置，研究人员又检测了启动子（H3K4me3）或增强子（H4ME1）的典型组蛋白标记物的分布，并使用H3K27ac确定具有转录活性的染色质。RB结合区域可细分为三个不同的组，两组包含位于启动子区域的RB峰，但RBCHIP-seq信号不同，Promoters-1的RB峰较强，而Promoters-2的RB峰较弱；第三组则包含主要位于增强子区域的RB峰（Non-promoters）。同时，在表达WT-RB的RPE1细胞中的E2F1ChIP-seq显示大部分RB结合的启动子被E2F1占据，而RB结合的增强子则没有。进一步分析发现，E2F基序在Promoters-1中高度富集，但在Promoters-2中却并不是最显著的，反而是其他转录因子（TF）结合基序更显著富集，如SP1和ETS家族成员。基因集富集分析（GSEA）表明，这两组RB结合启动子调节参与不同细胞功能的基因。值得注意的是，RB结合的增强子在Promoters-1或Promoters-2中均未显著富集，相反，非启动子RB结合位点富集了TF激活蛋白-1（AP-1）家族或CTCF和CTCF样蛋白BORIS结合的基序，参与信号通路和上皮-间充质转化的基因是RB介导调控的潜在靶点，这与RB结合的启动子调控的基因明显不同。

为了更好地理解RB结合位点并验证上述基序分析结果，尤其是位于启动子区域之外的基序，研究人员从RPE1细胞中生成了额外的ChIP-seq图谱，重点研究了两个与非启动子RB结合位点中最显著的基序富集相关的TF：AP-1复合物的核心成分c-Jun和CTCF。研究结果证实E2F1、c-Jun和CTCF确实存在于RB结合位点，且占据了95%。值得注意的是，这三种TF在RB结合位点上显示出很大程度上相互排斥的结合，提示了三种不同类型的RB结合部位。进一步地分析结果证实RB会被招募至三种根本不同类型的染色质位点——RB与E2F1共定位的启动子位点，RB与c-Jun共定位的增强子位点，以及由CTCF标记的第三组位点。而且RB与不同染色质区域的结合是由不同的TF介导的：E2F促进RB与启动子的结合，而AP-1控制RB与增强子的相互作用。与此同时，研究人员在BJ人成纤维细胞中进行了上述实验和分析，得到了与RPE1细胞中类似的结果，表明RB对E2F转录程序的调控是非常保守的，在E2F结合启动子之外的RB结合位点在两种细胞类型中都存在，这些位点与类似的TF相关，但位点的位置大多是细胞类型特异性的。

随后，研究人员探究了细胞周期进程对染色质结合RB分布的影响。为此，研究人员比较了表达RBΔCDK（阻滞在G1期）的细胞中每个结合位点的RBChIP-seq信号与表达WT-RB（增殖活跃）的细胞中的RB信号，结果显示在表达RBΔCDK的细胞中，RBChIP-seq信号在E2F1结合位点特异性增加，但RB与c-Jun结合染色质区域的关联减少。此外，虽然RB与CTCF结合位点的关联不太依赖于细胞周期，但在表达RBΔCDK的细胞中，RBChIP-seq信号在大多数CTCF区域减弱。由此表明在G1期阻滞的细胞中，RB向启动子重新分布，而远离增强子。与此同时，所有mP-RB也显示出比WT-RB更强的启动子区结合和较弱的非启动子区的结合，单磷酸化可改变RB在不同类型位点之间的分布。进一步分析发现，当RB在细胞周期进程中从启动子重新分配到增强子时，它会从一组基因的调控元件切换到另一组完全不同的基因的调控因子，主要调节MAPK通路相关基因的增强子，而且RB对这些靶基因的影响是细胞类型特异性和环境依赖性的。

本文关于RB具有不同类型的结合位点的发现无疑为RB与不同TF相互作用的概念增加了一个新的维度，虽然可以通过E2F1、CTCF和c-Jun的存在来区分三类RB结合位点，但不排除每个位点存在其他的TF。因此，为了识别结合在RB结合位点的蛋白质，在文章的最后，研究人员介绍了PanChIP——一种用于pan-ChIP-seq蛋白共定位分析的算法，可识别与RB结合位点的每个聚类相关的蛋白质集，利用其证实了RB与不同类型位点的不同TF相关。同时研究人员指出，无论使用何种分析方法，RB结合位点都可以分为三种根本不同的染色质类型：启动子、增强子和绝缘子，而RB的作用机制和生物学作用在这三种情况下可能是不同的。

综上所述，本文利用诱导替换系统用FLAG标记蛋白替换内源性人RB蛋白，成功获得了高质量ChIP-seq数据，详细描述了人类RB的作用机制，并给出了一种新的视角，指出RB远不只是与启动子结合，而是与三种根本不同类型的染色质区域结合——启动子、增强子和绝缘子。同时证实RB在增强子和启动子之间的分布随着细胞周期进程发生变化，RB在停滞细胞中优先与启动子结合，而在周期（或S期）细胞中则优先与增强子结合，从而影响了不同种类基因的表达，也因此表明RB不仅仅是细胞周期基因的调节因子，它的影响范围实际非常广泛和多变，由此绘制了一幅前所未有的RB作用复杂多变的迷人画作，用以解释RB更多的生物学特性，尤其是其多种功能丧失表型。

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